A kukorica ZmgstF4 génjének átvitele lúdfűbe (Arabidopsis thaliana)

Bittsánszky A, Gyulai G, Czakó M, Gullner G, Márton L, Pilinszky K, Király K, Kőmíves T
Kutatási újdonságok, 2012-06-29 15:30:56

1. Összefoglalás

A kukorica GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (ZmgstF4, syn.: gst27, NCBI: NP001105366) génjét vittük át lúdfűbe (Arabidopsis thaliana) virágmerítéses módszerrel. A transzformációs vektor (1. ábra) előállításához a standard rekombináns technikát alkalmaztuk. A kukorica ZmgstF4 (korábban gst27) gén cDNS szekvenciáját pCambia 1301 klónozó vektorba klónoztuk. A regenerált transzgénikus növényeket higromicin tartalmú táptalajon szelektáltuk. Három generáció felnevelése után a homozigóta vonalakat kiszelektáltuk, és a továbbiakban ezeket vizsgáltuk. A transzgén jelenlétét PCR-rel, az expresszióját RT-qPCR módszerrel bizonyítottuk. A transzgénikus növényekben a beépült gén kópiaszámát kvantitatív PCR módszerrel állapítottuk meg és a T3 növényeket funkcionálisan jellemeztük nehézfém és gyomirtó szer stresszben.

Image Text

1. ábra A ZmgstF4 transzgén vektorkonstrukciója a génszakaszok hosszának (DNS bp) jelölésével. LB és RB: az Agrobacterium tumefaciens tumorindukáló Ti plazmidjának a transzgént közrezáró határoló szakaszai (Left/Right Border). T 35S: az átíródó 35S-ZmgstF4-mRNS poli(A) szekvenciáját kódoló génszakasz a karfiol mozaikvírusból (CaMV). hptII: a transzformánsok higromicin-rezisztenciáját kialakító higromicin-foszfotranszferáz szelekciós marker gén. Pp 35S és P 35S: karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promótere dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával. ZmgstF4: a kukorica (Zea mays) gstF4 génje. T nos: Az Agrobacterium nopalin szintáz génjének átírását lezáró (terminátor) szekvenciája.


2. A GSTáz enzimek szerepe

A GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ enzimek (GSTázok, EC 2.5.1.18, MW < 50 kDa) kiemelkedő szerepet játszanak a biotikus és abiotikus stressz elleni védekezésben, növényekben és állatokban egyaránt (2a. ábra). A GSTáz-katalizált reakciókban a káros elektrofil xenobiotikumok kovalens kötésű konjugátumot képeznek a glutation tripeptiddel (GSH), majd, ahogyan ez a herbicidek 'méregtelenítésében’ történik, a GSHherbicid konjugátum (2b. ábra) a sejtüregbe (vakuolum) szállítódik az ABC-transzporterek (ATP binding casette) segítségével, és ezzel kikapcsolódik a sejt életéből.

Image Text

2a. ábra A glutation (GSH) alapú növényi detoxifikációs folyamatok molekuláris rendszere.

Az elektrofil xenobiotikumok (pl. kábítószerek, drogok, herbicidek stb.) olyan alacsony elektronsűrűségű reakciócentrummal rendelkező kémiai szennyezőanyagok, amelyek spontán reakcióba lépnek a nukleofil vegyületekkel, így a fehérjékkel és a nukleinsavakkal, ezzel károsítva a sejt metabolizmusát és genomját. A GSTáz klasszikus méregtelenítő funkciója a méreganyag-GSH konjugátum kialakulásának katalízise.

Image Text

2b. ábra A GTSáz katalizálta GSH-CDNP konjugátum kialakulásának mértéke in vitro paraquat herbicid (4x10-9 – 4x10-6 M) stresszben, két nyárfa (P. nigra és P. canescens) levélkorong-tenyészetében 1% és 2% cukorellátottság mellett.

A GSTázok felfedezése (1960) a humán drog-detoxifikációhoz fűződik. Növényekben való szerepük a kukorica atrazin-tűrésének megfejtésekor derült ki az atrazin-GSH konjugátum kimutatásával (1970), amely már nem mérgező a kukoricára. A GSTáz enzimek a növényekben nagy mennyiségben vannak jelen: a levelekben a vízoldható fehérjéknek közel 2%-át alkotják. Sok esetben a GSTáz enzimek a felelősek a növények herbicidrezisztenciájáért. A GST-ázokat többgénes, nagy és diverz géncsaládok kódolják, amelyek, szekvenciájuk alapján ma már 10-12 csoportba (géncsalád) sorolhatók, ezek az A (alfa-), a prokarióta B (béta-), a D (delta-), a mitokondriális K (kappa-), valamint az M (mu-), O (omega-), F (phi-), T (théta-), U (tau-), Z (zéta-), illetve a GST-szerű L (lambda-) és a trimer M (mikroszomális-) GST enzimek. Egy további, az S (sigma)-GST az állati prosztaglandin szintáz enzime.

Image Text

3a. ábra A lúdfű (Arabidopsis thaliana) 51 klónozott AtGST izoenzimének (F-, T-, U-, Z-enzimcsaládok) és a kukoricából klónozott ZmGSTF4 (●) enzimének aminosav-szekvencia rokonsági kladogramja. (ME - Minimum Evolution módszer, MEGA5, x1000 ismétlés/bootstrap). Az egyes GST géncsaládokat (F, T, U, Z) külön szín jelzi a relatív genetikai távolság (skála: aminosav-eltérések száma per mérce) megadásával.

A baktériumok prokariotikus GST enzimei a B (EcGSTB) (Ec – Escherichia coli) csoportba tartoznak. A teljes Arabidopsis genom szekvenciája alapján ismertté váltak a növényi GST enzimcsaládok, amelyek az F-, Z-, T-, és az U-GST csoportba tartoznak (3a, b, c. ábra; 1. táblázat). A T-GST és a Z-GST-ok közösen az állatokban és a növényekben. Az A-, és M-GST enzimek a klasszikus humán gyógyszer/drog metabolizmus részei, az ismert emberi (Homo sapiens) GST enzim csoportokon belül, melyek a HsGST-A, HsGST-M, HsGST-O, HsGST-S, és a HsGST-T.

Image Text

3b. ábra A lúdfű (Arabidopsis thaliana) három AtGSTt1-3 enzimének aminosav-szekvencia illesztése (BioEdit) alacsony fokú diverzitást mutat ellentétben az AtGSTu- és AtGSTf izoenzimekkel (ld. 3a. ábra).

Image Text

3c. ábra A lúdfű AtGSTF4 (a) és a kukorica ZmGSTF4 (b) ezimek aminosav-összetételének összehasonlító spirálkerék diagrammjai (helical wheels). (kék - alifás-; piros - negatív töltésű; fekete - pozitív töltésű aminosavak). Apoláros, hidrofób oldalláncú aminosavak: A (alanin), F (fenilalanin), G (glicin), I (izoleucin), L (leucin), M (metionin), P (prolin), V (valin), W (triptofán). Poláros, töltéssel nem rendelkező aminosavak: C (cisztein), G (glicin), N (aszparagin), S (szerin), Q (glutamin), T (treonin), Y (tirozin). Savas oldalláncú (negatív töltésű) aminosavak: D (aszparaginsav), E (glutaminsav). Bázikus oldalláncú (pozitív töltésű) aminosavak: H (hisztidin), K (lizin), R (arginin).

Image Text

4a. ábra Az Arabidopsis (At), a kukorica (Zm) és a nyárfa (Pt) GSTF4 proteinjeinek összehasonlító szekvenciaillesztése (BioEdit) (jelzések: azonos/konszenzus aa(•); hiányzó aa (-); eltérő aa: az aminosavak nevének egybetűs jelölésével).

1. táblázat. A lúdfű (Arabidopsis thaliana) AtGST1-51 (F-, T-, U-, Z GST) és a kukoricából klónozott (Zea mays) transzgénikus ZmGSTF4 fehérjék aminosav-összetételéből szerkesztett evolúciós divergenciamátrixa (MEGA5) a legmagasabb értékek (2.0 aa változás/lokusz) jelölésével.

[ 1] F2; [ 2] F3; [ 3] F4; [ 4] F4(2); [ 5] F4(3); [ 6] ZmGSTF4; [ 7] F5; [ 8] F6; [ 9] F7; [10] F8; [11] F9; [12] F9(2); [13] F10; [14] F11; [15] F12; [16] F13; [17] F14; 18] T1; [19] T2; [20] T3; [21] TClHQR-ase;
[22] U1; [23] U2; [24] U3; [25] U4; [26] ; U5; [27] U6; [28] U7; [29] U8; [30] U9; [31] U9.; [32] U10; [33] U11; [34] U12; [35] U13; [36] U14; [37] U15; [38] U16; [39] U17; [40] U18; [41] U19; [42] U20; [43] U21; [44] U22; [45] U23; [46] U24; [47] U25; [48] U26; [49] U27; [50] U28; [51] Z1; [52] Z2.

Image Text

A gst gének nagy száma és a kromoszómán való csoportosulásuk (klasztereik) evolúciós génsokszorozódás következményei. Arabidopsisban 51 gst gén található (3a. ábra), a kukoricában 42 (12 F-, 28 T-, és 2 Z-gst) (4a, b. ábra***), a szójában 25 (20 **T-, 4 F-, és 1 Z-gst). A GST-M enzimcsalád enzimei emlősökben hasznos evolúciós markerek (4c. ára).

Image Text

4b. ábra A kukorica (Zea mays) ZmGSTF4 (223 aa, NCBI # NP_001105366) evolúciós rokonsági dendrogramja és diverzitása a kukorica (Zea mays) különböző mintáinak genomjaiban az ősi kapcsolatot mutató nyitvatermőkig (NJ – Neighbour Joining NCBI; MEGA5, x 1000 ismétlés/bootstrap). Az egyszikű fajokon (zöld) belül a kukorica GST izoenzimeit (piros), a kétszikűekét (kék) és a nyitvatermő fajokét (lila) eltérő színek jelzik, a genetikai rokonságot skála (0,35) jelzi.

A GST enzimek dimer felépítésűek (homo- és heterodimerek), ezért valószínű, hogy génduplikációval jöttek létre az evolúció során. A dimer mindkét aminosav (aa) láncának aminocsoport végén (N-terminális) található a konzervatív aa-szekvenciájú GSH-kötő szakasz (G-domén), a karboxilcsoport végén pedig (C-terminális) a hidrofób szubsztrát-kötő H-domén. A két szakasz között rövid (10-15 aa) kapcsoló szakasz található. A homodimer GSTk (az F-, és a T-GST) két alegységét, értelemszerűen, ugyanaz a gén, míg a heterodimerekét két különböző gén kódolja. A szabad heterodimer GST kombinációk tovább növelték (elsősorban a növényekben) a GST enzimek funkcionális diverzitását, és ezzel a növények evolúciós alkalmazkodó képességét, melyben a gyomirtó szerek megjelenésének indukciós hatása is feltételezhető. Pl. a kukorica F-GST-je a ZmGSTF1-1 homodimer (az 1-1 jelzés mutatja). Herbicid ellen védő kezelés után azonban kimutatható a heterodimer ZmGSTF1-2 GST is. A gst gének expressziója szövetspecifikus, de az F- és az U-gst gének stresszinduktívak is; pl. a kukorica ZmGSTF2 génje csak a gyökérben működik, de herbicidkezelésre a levélben is expresszálódik. A U-gst gének hormon által indukálhatóak is (auxinokkal és citokininekkel).

Image Text

4c. ábra Az emlősök GST-M enzimcsaládjának rokonsági MP (maximum parsimony) dendrogramja (MEGA5; x 1000 ismétlés/bootstrap). A genetikai rokonságot skála (5 aa eltérés/mérce) jelzi.


3. A ZmgstF4 transzformáns lúdfű (Arabidopsis thaliana) funkcionális jellemzése gyomirtó szer (metolaklór) és nehézfém(Cd, Zn) stresszben

A transzgénikus vonalak funkcionális igazolására biotesztet végeztünk gyomirtó szer és nehézfém stresszben.

Image Text

5. ábra Metolaklór herbicid teszt. A természetes (WT) lúdfű (Arabidopsis thaliana) klónja (Col-gl1) és a ZmgstF4 génnel transzformált lúdfű (GMO) T3 regeneránsai csírázási tesztben 200 μM metolaklór tartalmú ½MS táptalajon (a) és tőzegkockában (b) 3 nap hidegkezelést követően 20 nap után, 16/8 fény/sötét fotoperiódus alatt nevelve, 22°C-on).

A metolaklórral átitatott szűrőpapíron csíráztatott transzgénikus T3 Arabidopsis növények magvai, valamint levelei a metolaklór gyomirtó szer permetezése után minden kezelésben nagyfokú rezisztenciát mutattak (5. ábra). A GST-emzimaktivitás szignifikánsan magasabb volt a T3 ZmgstF4 növényekben kadmiumstresszben, viszont a cinkstressz nem indukált szignifikáns GST-aktivitásváltozást még extrém magas koncentrációban (1500 μM) sem (6. ábra).

Image Text

6. ábra GST-aktivitás CdSO4 és ZnSO4 stresszben. A ZmgstF4 kukoricagénnel transzformált lúdfű (Arabidopsis thaliana) GLUTATION-S-TRANSZFERÁZ (GSTáz) aktivitása (az 1-klór-2,4-dinitrobenzol CDNB-GSH konjugátum képződésének mértéke alapján) a (■) kadmium Cd- (a) és (■) cink Zn- (b) stresszben összehasonlítva a WT (■) lúdfűvel.

A stabil homozigóta transzgénikus ZmgstF4 lúdfűvonalak kiváló modellként szolgálhatnak különböző xenobiotikumok fitoremediációs folyamatainak vizsgálatához, és készen állnak keresztes virágúakba (Cruciferae) történő átvitelre keresztezéssel.


Irodalom:

  • Bittsánszky A, G Gyulai, T Kőmíves (2010) Arabidopsis thaliana overexpressing Zea mays glutathione S-transferase: modelling an effective phytoremediation. J Biotechnology 150, Supplement 1: 486.
  • Czakó M, X Feng, Y He, D Liang, M Márton (2006) Transgenic Spartina alterniflora for phytoremediation. Environmental Geochemistry and Health (2006) 28: 103–110.
  • Gullner G, G Gyulai, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Kőmíves (2005) Enhanced inducibility of glutathione S-transferase activity by paraquat in poplar leaf discs in the presence of sucrose. Phyton 45: 39–44.
  • Gyulai G, A Bittsánszky, G Gullner, Gy Heltai, K Pilinszky, E Molnár, T Kőmíves (2012) Gene reactivation induced by DNA demethylation in Wild Type and 35S-gshI-rbcS transgenic poplars (Populus x canescens). Novel plant sources for phytoremediation. J Chemical Science and Technology 1: 9–13.
  • Kőmíves T, G Gullner (2005) Phase I xenobiotic metabolic systems in plants. Z Naturforsch 60c: 179–185.
  • Márton, L, GJ Wullems, L Molendijk, RA Schilperoort (1979) In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature 277: 129–131.
  • Pilinszky K, A Bittsánszky, G Gyulai, T Kőmíves (2012) Response of Arabidopsis thaliana to stress by zinc and cadmium. Növénytermelés DOI: 10.1556/Növényterm.61.2012. Suppl. 5: 451–454.

A vizsgálatokat az OTKA-K77641 és az OTKA-PD75169 pályázat támogatta.

A cikk letöltése pdf formátumban.

Du­dits Dénes aka­dé­m­i­kus
A pre­cí­z­i­ós ne­me­sí­t­és mint bi­o­gaz­dál­ko­dá­si in­no­vá­c­ió


Dr. Györ­gyey Já­n­os
Az elő­r­e­lé­p­és le­he­tő­s­é­g­ei a gén­tech­no­ló­g­i­á­r­ól va­ló tár­s­a­dal­mi vi­tá­b­an


Image Text

Legfrissebb
  • Batáta, az anyatermészet génmódosítása

    A há­z­i­a­sí­tott éd­es­bur­go­nya és an­nak kö­z­e­li vad ro­ko­nai kö­z­ött fon­tos kü­l­önb­sé­g­et fe­de­zett fel egy ku­ta­tás. A ba­tá­ta ge­nom­já­b­an ugya­n­is ket­tő, Ag­ro­bak­té­r­i­um ál­tal be­vitt gént ta­lál­tak. Ezek a gé­n­ek pe­dig nem csak je­len van­nak a ge­nom­ban, ha­nem ki is fe­je­ződ­nek, ami ar­ra en­ged kö­v­et­kez­tet­ni, hogy olyan hasz­nos tu­laj­don­ság ki­a­la­kí­t­á­s­á­b­an van sze­re­pük, ami a há­z­i­a­sí­t­ás so­rán sze­lek­ci­ós előnyt je­len­tett a ba­tá­t­á­n­ak.

  • Mérgező élelmiszer a polcokon

    A GM nö­v­é­nyek­kel el­len­tét­ben a nö­v­ény­vé­d­ő­s­z­er­rel szen­nye­zett ter­mé­nyek­ről ke­vés hír szól. Ér­d­e­mes át­bön­g­ész­ni a táb­lá­z­a­tot. Köz­ben fel­me­rül a kér­d­és, hogy vegy­s­zer­men­tes GM nö­v­ény­től vagy a mér­ge­ző re­tek­től kell-e job­ban fél­ni.

  • Mit mondanak azok a kutatások, amiket nem a multik pénzelnek?

    Az el­múlt 60 év so­rán 698 ku­ta­tás fog­lal­ko­zott GM-nö­v­é­nyek­kel. A köz­le­mé­nyek több, mint fe­le tel­je­sen füg­g­et­len ku­ta­tók­tól szár­ma­zik, va­gy­is nem "lob­bi­zik" az egyik vagy a má­s­ik ol­dal mel­lett - nem ér­d­e­k­elt a kí­sér­l­e­tek ki­me­ne­te­lé­b­en. Ezek a füg­g­et­len ku­ta­tók pe­dig rend­re biz­ton­sá­g­os­nak ta­lál­ták a gén­tech­no­ló­g­i­á­v­al ne­me­sí­tett nö­v­é­nye­ket.

Korábbi hírleveleink:
Hírlevél feliratkozás

Iratkozzon fel kéthavonta megjelenő hírlevelünkre email címével!

Keresés