Tavaszi árpa termőképességének javítása

Nagy Bettina
Hírek, 2016-09-29 11:38:00

Tavaszi árpa termőképességének javítása a szemméret-meghatározásában szerepet játszó HvGW2 gén antiszensz csendesítésével

Nagy Bettina*, Horváth Gábor
*nagy.bettina@brc.mta.hu
MTA SZBK Növénybiológiai Intézet


Az abiotikus stresszhatásoknak ellenálló növények előállítása mellett a jelenleg folyó árpanemesítési kutatások kiemelkedő fontosságú feladata lehet a potenciális termés növelése, így például a gyenge szárszilárdság kiküszöbölése, a bokrosodási hajlam javítása vagy a betakarított szemtermés mennyiségének növelése. A termésösszetevők optimalizálását szolgáló tulajdonságok sok gén által irányított mennyiségi bélyegek, amelyek genetikai determinációjáért felelős kromoszóma régiókat, QTL-eket nagy számban térképeztek már mind a búza-, mind a rizs-kromoszómákon (Wang et al. 2009; Thongjuea et al. 2009). A hasadó populációkon végzett markerezési eljárások lehetővé tették azt is, hogy az ilyen, nagy hatású QTL-ek hátterében működő gének azonosíthatók és izolálhatóak legyenek. Így a növényi géntechnológia közvetlen szerephez jut a termőképesség javítására irányuló nemesítésben is.

Munkánkhoz irodalmi adatok alapján a rizs 2-es kromoszóma rövid karán elhelyezkedő - a rizs szem tömegét és szélességét meghatározó – QTL-t, a Grain Weight 2 (GW2) gént választottuk, melynek géntérképezésen alapuló azonosítását és klónozását Song és mtsai. (2007) végezték el. A szerzők két, szemméretben jelentősen különböző fajta keresztezésével állították elő a térképezési populáció F2 generációját. Mint az 1. ábrán látható, az indica FAZ1 fajta kis szemeket produkál (17,9 g ezerszemsúly), a japonica WY3 fajta szemei pedig igen nagyméretűek (41,9 g ezerszemsúly). Az F1 növények öntermékenyítéséből származó F2 növények visszakeresztezése a FAZ1 növényekkel a BC1F1 generáció szemeit eredményezte. Az ezekből felnevelt növények közül kiválasztották azokat, amelyek heterozigóták abban a GW2 régióban, ahol a keresett gén található, viszont a FAZ1 szülőre nézve minden más régióban homozigóták. A gén azonosítását követően kiderült, hogy a széles szemű WY3 fajtában hibásan működött a GW2 gén, amely indokolttá tette az ún. antiszensz konstrukciók elkészítését a gén szemméret befolyásolásában betöltött szerepének meghatározására. A szerzők a gént fordított, azaz antiszensz (AS) orientációban fejeztették ki tehát ciszgénikus növényekben. Ilyenkor a növénytranszformálás során növény sejtjében jelen lévő célzott gén szekvenciájára specifikus AS génnel, vagy annak AS fragmentumával transzformálják a növényt. Az AS technika lényege, hogy az AS génről a DNS másik szála fog átíródni RNS-re és ezt az RNS-t antiszesz RNS-nek (AS RNS) nevezzük. Mivel a DNS két szála komplementer egymással, a szensz és antiszensz génekről átíródó mRNS+ és RNS– szálai is komplemeterek. Tehát ha a sejtekben egy időben termelődnek, akkor a citoplazmában összekapcsolódva róluk fehérje sem tud szintetizálódni, mellyel a génműködés gátlása magyarázható. Song és mtsai. (2007) közleményében az OsGW2 gén ilyen technikával végzett elhallgattatása növelte a rizsszemek szélességét, szensz (azaz eredeti) orientációban történő alkalmazása pedig a szemméret csökkenését eredményezte. Két homozigóta, közel izogén vonal összehasonlításából kiderült, hogy a mutáns GW2 allél a rizs szemek szélességének jelentős növekedésével szignifikánsan megnövelte a szemtermés súlyát, mely a szem vastagságában és hosszában bekövetkezett enyhe növekedéssel párosult. A GW2 gén egy RING-domént tartalmazó E3 ubiquitin ligáz fehérjét kódolt, mely az ubiquitin-függő proteaszóma rendszerben, a fehérjék lebontásában, degradációjában játszik szerepet, ezek a 26S fehérjebontó enzim komplexumon történő fehérjebontást katalizálják. A RING-domént tartalmazó fehérjék számos sejtfunkció vagy egyedfejlődési folyamat szabályozásában szerepet játszanak, beleértve a transzkripció, a jelátvitel, a rekombináció és a sejtciklus szabályozását.


Image Text

1. ábra: A nagy szemű rizs kialakításáért felelős GW2 gén izolálása nagyfelbontású genetikai térkép segítségével (újrarajzolva Song et al. 2007. alapján). a) a két szülői fajta rizsszemeinek mérete; b) A GW2-régiót közrefogó molekuláris markerek (WO24, WO04) a második kromoszómán és a rizs genomikus DNS-darab bakteriofág B1 vektorban (AP005004); c) stabil rekombináns vonalak a FAZ1 szülőkkel történt visszakeresztezések után; d) az antiszensz (AS) transzformánsok szélesebb és a szensz (S) transzformánsok kisebb szemei a kontroll rizsszemekhez viszonyítva; e) a konkrét szemméretadatok a kétféle transzformáns vonal növényein.


Az irodalomban fellelhető adatok alapján tehát bebizonyosodott, hogy a GW2 fehérje működése negatívan befolyásolja a gabonák szemtermésének méretét, ami arra utalt, hogy a GW2 E3 ligáz aktivitással az ubiquitin közvetített proteolízisen át a sejtosztódás negatív regulátoraként működik. Azonban a GW2 gén szerepe a sejtciklus szabályozásában még nem teljesen tisztázott. A RING-domén típusú fehérjék többségénél a fehérjék N-terminális vége hat kölcsön az E2 ubiquitin-konjugáló enzimmel, a fennmaradó részen pedig további fehérje-fehérje kölcsönhatási domének találhatóak, melyek a szubsztrát kötésért felelősek (Song et al. 2007). A GW2 gén természetben előforduló WY3 allélja – amely a fehérje egy 310 aminosav deléciót tartalmazó csonka változata – ún. intakt RING-doménnal rendelkezik, így megtartja E3 ubiquitin ligáz aktivitását, a mutációval érintett csonkolt régió pedig a szubsztrát kötő domént tartalmazhatja. A gén funkciójának teljes hiányát okozó null-allél és a füzérvirágzatban található szemtermésben lévő megnövekedett sejtszám egybeesése az sugallja, hogy a WY3 allél nem lép kölcsönhatásba a sejtosztódást befolyásoló szubsztrátokkal, így nem játszik szerepet a fehérje degradációs útvonalban sem. Első lépésben adatbázisból azonosítottuk az árpa GW2 homológokat. Megállapítottuk, hogy az árpa genomja, ugyanúgy, mint a rizsé, két ilyen gént kódol, azonban a nukleotid sorrendek hasonlósága miatt egyértelműen azonosítható volt a szemfeltöltődésben szerepet játszó gén. Mind egyszikűek, mind a kétszikűek esetében két homológot találunk, azonban az ismert kétszikű szekvenciák egy jól definiálható csoportot alkotnak, míg az egyszikűek esetében a kétfajta homológ egymástól élesen elkülöníthető. A két csoport közötti fehérjeszintű azonosság 40% körüli, azonban ez főként a fehérjék első felére koncentrálódik, ahol az ubiquitin ligáz aktivitásért felelős RING-domén található, a szubsztrát kötésért feltehetően felelős második szakasz szekvenciája teljesen eltérő. Ebből arra következtethetünk, hogy a fehérjék élettani funkciója is jelentősen különbözhet, noha mindkét esetben a fehérje degradációs útvonal irányító enzimeiről van szó. A homológ szekvenciák összehasonlítása alapján tehát a fehérje C-terminális felét kódoló szakasz tette lehetővé a specifikus antiszensz technika alkalmazását. A megfelelő szakasz izolálását a genomikus struktúra alapján végeztük el. Ehhez a rizs gén exon-intron szerkezetét vettük figyelembe és olyan primereket terveztünk, melyek egyrészt a genomikus szekvenciáról képesek felamplifikálni egy olyan régiót, mely megfelel az átíródott gén egy szakaszának; másrészt pedig specifikusan képes antiszensz (AS) hatást kifejteni az árpa GW2 homológon. Kész konstrukcióinkat restrikciós emésztéssel és szekvenálással is ellenőriztük, majd a megfelelőnek bizonyult konstrukciót LBA4404 Agrobacterium tumefaciens törzsbe transzformáltuk. Az Agrobacterium tumefaciens a Rhizobiaceae családba tartozó, talajlakó, anaerob baktérium, mely egy természetes génsebészhez hasonlóan a növények sebzési helyein keresztül képes a növény sejtjeinek transzformálására. Az árpa Agrobacterium által közvetített stabil genetikai transzformációját Hensel és Kumlehn (2004) által kidolgozott módszer szerint végeztük el (sematikus vázlat, lásd 2. ábra).


Image Text

2. ábra: Árpatranszformáció sematikus ábrázolása


A termésnövelés befolyásolásának eredményeit az egyik kiválasztott, a rizs GW2 génnel közeli homológ (ASHvGW2.1) példáján mutatom be, az alábbiakban részletezve. Az ASHvGW2.1 konstrukció esetén összesen 13 növényt regeneráltunk, melyek a későbbi PCR analízisek során 4 független transzformáns vonalnak bizonyultak. Az antiszensz hatás a növény vegetatív növekedési fázisában erőteljes fenotípus változást nem okozott, azonban a vegetációs idő végén mért növénymagassági adatok alapján a transzformánsok jóval magasabbnak bizonyultak a kontroll növényeknél (3./A ábra). Aratáskor a növénymagasságból adódóan ezek a növények nagyobb száraztömeggel (3./B ábra) voltak jellemezhetőek. Szemszámolási adatainkat elemezve megállapíthattuk, hogy bár transzformáns vonalunk összességében kevesebb szemszámmal volt jellemezhető, nagyobb eltérések azonban a kontroll növényekhez viszonyított a fő- vagy mellékhajtások számában mutatkoztak. A transzformáns növényeken kevesebb főhajtást számolhattunk meg, míg mellékhajtások számában az ASHvGW2.1 transzformánsok meghaladták a kontroll növényeket (3./C ábra). Hasonló eredmények mutatkoztak a fő- és mellékhajtásokon mért ezerszemtömegben is: a mellékhajtásokon mért ezerszemtömegek a transzformáns vonal esetében felülmúlták a kontroll növényeken mérteket, még a kevesebb szemszám ellenére is (3./D ábra). Annak eldöntésére, hogy a mellékhajtásokon mért magasabb szemsúly a szemek mely növekedési (szélesség, hosszúság, tömeg) paraméterével magyarázhatóak, a magokat számítógépes pixelanalízisnek vetettük alá (Sass László, MTA SZBK). Az adatok alapján a mért paraméterek tekintetében eloszlási görbéket határozhattunk meg. Összességében elmondhattuk, hogy a nagyobb ezerszemtömegek elsősorban a szemek szélesebb voltának (3./E ábra), valamint ebből adódó nagyobb tömegükkel voltak magyarázhatóak a transzformánsok esetében (3./F ábra), ehhez társultak a szemhosszúságban mért csekély változások, ami összhangban van az irodalomban fellelhető eredményekkel is (Song et al., 2007).


Image Text

3. ábra: A HvGW2.1 gén antiszensz transzformációjának hatása a transzformáns növények növénymagasságának (A), száraztömegének (B), mellékhajtások számának (C) és az azokon mért ezerszemtömegek (D) alakulására, valamint szemsúly (E) és szemszélesség (F) értékeire.

Az eredményként kapott transzformánsok használhatóak lennének a termésmennyiség növelésére irányuló nemesítési eljárás alapanyagaiként, egységnyi termőterületről nagyobb ezerszemtömeggel, nagyobb szemtermés lenne betakarítható. A kapott eredmények alapján arra is lehet következtetni, hogy ezek az ubiquitin ligázok alapvető meghatározói lehetnek a vegetatív-generatív fázisok közötti átváltásnak. A gén szemméretet befolyásoló markerként történő alkalmazhatóságának különböző szemméretekkel rendelkező rozs, triticale double haploid (DH) populációkon történő vizsgálata egy jövőbeli kutatómunka tárgyát képezi. Igen érdekes lehet még a fenotípusok elemzése kétszikűekben is, mivel jelentős hatásuk lehet a biomassza mennyiségének meghatározásában.


Köszönetnyilvánítás

A projekt NAP_BIO_06 (2007-2010) ‘Növényi génforrás’ Magyar-Német Együttműködési Pályázat támogatásával valósult meg.


Felhasznált irodalom:

WANG R. X., HAI L., ZHANG X. Y., YOU G. X., YAN C. S., XIAO S. H. (2009): QTL mapping for grain filling rate and yield-related traits in RILs of the Chinese winter wheat population Heshangmani x Yu8679. Theoretical and Applied Genetics, 118: 313–325. p.

THONGJUEA S., RUANJAICHON V., BRUSKIEWICH R., VANAVICHIT A. (2009): RiceGeneThresher: a web-based application for mining genes underlying QTL in rice genome. Nucleic Acid Research, 37: 996–1000. p.

SONG X. J., HUANG W., SHI M., ZHU M. Z., LIN H. X. (2007): A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase. Nature Genetics, 39: 623–630. p.

HENSEL G., KUMLEHN J. (2004): Genetic transformation of barley (Hordeum vulgare L.) by co-culture of immature embryos with Agrobacteria. Chapter 3, 35-44. In: Curtis, I.S. (ed): Transgenic crops of the world: essential protocols. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands, 454. p.

A cikk letöltése pdf formátumban.

Sze­ge­di Tu­do­má­nyegye­tem, Bio­ló­g­ia Épü­l­et, Szent-Györ­gyi Al­bert te­rem (BI-164)
Sze­ged, Kö­z­ép fa­sor 52.

2018. má­j­us 16. 14 óra

Dr. Bő­s­ze Zsu­z­san­na

"Ge­nom­s­zer­kesz­tés­s­el lét­re­ho­zott ha­s­zon­ál­l­at mo­del­lek a gyó­gyí­t­ás szol­gá­la­tá­b­an"

Dr. Bán­fal­vi Zsófia

"Ge­nom­s­zer­kesz­tés­s­el ne­me­sí­tett nö­v­é­nyek: ho­gyan csi­nál­juk és mi­re jók?"

Dr. Györ­gyey Já­n­os

"GMOk-e a gén­s­zer­kesz­tett él­ő­l­é­nyek? És ha igen, mi­ért nem?"


Ima­ge Text

Bu­da­pest, Vil­lá­nyi út 29-43.
K épü­l­et
Szent Ist­ván Egye­tem Bu­dai Cam­pu­sá­n­ak K2-es előa­dó­ja

2018 . áp­ri­lis 24. 17 óra

Dr. Éva Csa­ba

"Crispr/Cas ge­nom­s­zer­kesz­tés a ne­me­sí­t­és­ben:mű­kö­d­és és al­kal­ma­zá­si le­he­tő­s­é­g­ek"


flyer

A Ma­gyar Tu­do­má­nyos Aka­dé­m­ia a Ma­gyar Tu­do­mány Ün­n­e­pe ren­dez­vény­s­o­ro­za­tá­n­ak ke­re­tén be­lül tisz­te­let­tel meg­hív­ja prof. Dr. Du­dits Dénes aka­dé­m­i­kus előa­dá­s­á­ra.


2017. no­vem­ber 6., 18:00 óra MTA Szék­ház, Dísz­te­rem

1051 Bu­da­pest, Szé­c­he­nyi Ist­ván tér 9.

Du­dits Dénes aka­dé­m­i­kus
A pre­cí­z­i­ós ne­me­sí­t­és mint bi­o­gaz­dál­ko­dá­si in­no­vá­c­ió


Dr. Györ­gyey Já­n­os
Az elő­r­e­lé­p­és le­he­tő­s­é­g­ei a gén­tech­no­ló­g­i­á­r­ól va­ló tár­s­a­dal­mi vi­tá­b­an


Image Text

Legfrissebb
  • Batáta, az anyatermészet génmódosítása

    A há­z­i­a­sí­tott éd­es­bur­go­nya és an­nak kö­z­e­li vad ro­ko­nai kö­z­ött fon­tos kü­l­önb­sé­g­et fe­de­zett fel egy ku­ta­tás. A ba­tá­ta ge­nom­já­b­an ugya­n­is ket­tő, Ag­ro­bak­té­r­i­um ál­tal be­vitt gént ta­lál­tak. Ezek a gé­n­ek pe­dig nem csak je­len van­nak a ge­nom­ban, ha­nem ki is fe­je­ződ­nek, ami ar­ra en­ged kö­v­et­kez­tet­ni, hogy olyan hasz­nos tu­laj­don­ság ki­a­la­kí­t­á­s­á­b­an van sze­re­pük, ami a há­z­i­a­sí­t­ás so­rán sze­lek­ci­ós előnyt je­len­tett a ba­tá­t­á­n­ak.

  • Mérgező élelmiszer a polcokon

    A GM nö­v­é­nyek­kel el­len­tét­ben a nö­v­ény­vé­d­ő­s­z­er­rel szen­nye­zett ter­mé­nyek­ről ke­vés hír szól. Ér­d­e­mes át­bön­g­ész­ni a táb­lá­z­a­tot. Köz­ben fel­me­rül a kér­d­és, hogy vegy­s­zer­men­tes GM nö­v­ény­től vagy a mér­ge­ző re­tek­től kell-e job­ban fél­ni.

  • Mit mondanak azok a kutatások, amiket nem a multik pénzelnek?

    Az el­múlt 60 év so­rán 698 ku­ta­tás fog­lal­ko­zott GM-nö­v­é­nyek­kel. A köz­le­mé­nyek több, mint fe­le tel­je­sen füg­g­et­len ku­ta­tók­tól szár­ma­zik, va­gy­is nem "lob­bi­zik" az egyik vagy a má­s­ik ol­dal mel­lett - nem ér­d­e­k­elt a kí­sér­l­e­tek ki­me­ne­te­lé­b­en. Ezek a füg­g­et­len ku­ta­tók pe­dig rend­re biz­ton­sá­g­os­nak ta­lál­ták a gén­tech­no­ló­g­i­á­v­al ne­me­sí­tett nö­v­é­nye­ket.

Korábbi hírleveleink:
Hírlevél feliratkozás

Iratkozzon fel kéthavonta megjelenő hírlevelünkre email címével!

Keresés