Transzgénikus nyárfák (35S-gshI-11ggs és 35S-rbcS-gshI-6lgl) alkalmazása a fitoremediációban

Gyulai Gábor, Király Kata, Bittsánszky András, Malone P. Renee, Gullner Gábor, Kőmíves Tamás
Kutatási újdonságok, 2012-06-28 10:59:34

1. Összefoglalás

A transzgénikus növénynemesítésnek kiemelt szerepe van a fák mindkét nagy csoportjában, a tűlevelű nyitvatermőkben és a zárvatermő lombos fákban (ez utóbbin belül az erdei és gyümölcsfákban). Az erdei nyitva- és zárvatermő fákban elsősorban a fa mennyiségi és minőségi javítására, a gyors növekedésre és ellenállóságra való nemesítés a cél. A gyümölcsfák esetében az (a)biotikus stresszt tűrő képesség és a termés mennyiségének, minőségének és beltartalmi értékeinek a növelése, valamint az évekkel előrehozott virágzás indukciója a fő cél. A fák hosszú életideje megnehezíti ezeknek a céloknak az elérését, de a gyors növekedésű fákban (pl. a nyárfák) sok előrehaladás történt. Írásunk bevezető részében áttekintjük a fás növények nemesítésének evolúciós lehetőségeit, főbb csoportjait és tulajdonságait, majd összefoglaljuk a legfontosabb transzgénikus nyárfa kísérleteket, és beszámolunk a 35S-gshI transzgénikus szürke nyárban (Populus x canescens) elért eredményeinkről.


2. Bevezetés

A virágos növények evolúciójában nem az ’egyszerűbb’ lágyszárú, egy/kétéves növények jelentek meg először, hanem a hosszú életidejű, évelő, ’bonyolultabb’ fás növények: a fák. Ezért nem a lágyszárú, hanem a fás életforma az ősibb (’fejletlenebb’), de ’sikeresebb’, az életidő (ld. több ezer évig élő fenyők) és a nagyság (ld. mamutfenyő) értelmében. Mind a három ’leg’-növény nyitvatermő fa É-amerikai géncentrummal: a Föld legnagyobb tömegű növénye az óriás mamutfenyő (Sequoiadendron giganteum), a legmagasabb növénye a tengerparti mamutfenyő (Sequoia sempervirens) és a legtovább élő növénye a szálkásfenyő (Pinus longaeva) (a legöregebb élő példánya ma 4789 éves) (1. ábra). A nyitvatermőknek (pl. fenyők) minden faja fa (nincs ’lágyszárú, egynyári nyitvatermő’).

A fás növényeken belül a nyitvatermő ’tűlevelű’ fák (nem minden nyitvatermőnek tű alakú a levele) ősibbek a zárvatermő lombos fáknál. A nyitvatermők fák fajszámban (Gingko 1 faj, Gnetumok 66 faj, Szágópálmák 185 faj, Fenyők - Coniferales 556 faj; összesen cca. 750 faj) elmaradnak a 250.000-es fajszámú zárvatermőktől. Fajdiverzitásban a nyitvatermők talán ’nem használták ki’ a megjelenésük óta eltelt 350 millió évet, szemben a zárvatermők 150 millió éves fejlődésével. Igaz, a legkorábban megjelent podokarpuszok 169 faja és az 50 millió évvel később (200 millió évvel ezelőtt) megjelent fenyők (Pinaceae) 191 faja igen diverz fajkialakulást jelez.

Image Text

1. ábra A három ősi mamutfenyő törzse, levélzete és toboza. (A) az óriás mamutfenyő (Sequoiadendron giganteum) egy példánya, és 40 éves telepítése a gödöllői Arborétumban (fotó: Krassay L. 2011); (B) az elágazásra hajlamos tengerparti mamutfenyő (Sequoia sempervirens); és (C) az ősi kínai mamutfenyő (Metasequoia glyptrostroboides) (fotó: Gyulai Zs. G., Freiburg, 2010).

Genetikai értelemben a nyitvatermők további két „leg”- tulajdonságban is közel állnak az elsőséghez. A Pinusok hatalmas genomméretét (20 x 109 DNS bp) csak néhány liliom múlja felül (40 x 109 DNS bp), összehasonlítva a búza (16 x 109 DNS bp; 2n=6x=42), az ember (3,6 x 109 DNS bp; 2n=2x=46) és a nyárfa igen kis (0,55x109 bp; 2n=4x=38) genomméretével (2. ábra).

Image Text

2. ábra A genom mérete és kromoszómaszáma. Nyitvatermő (Pinus) és zárvatermő (Populus) fák összehasonlítása a zárvatermő egy- és kétszikűekkel, valamint az emberi genommal.

Sejtszervek (kloroplasztisz és mitokondrium)

A teljes kloroplasztisz genom (cpDNS) méretében is az egyik nyitvatermő cikászpálma (Cycas taitungensis) felülmúlja (163.403 bp; #NC009618) a zárvatermő fákat (3. ábra). Igaz, a Cathaya argyrophylla fenyő (csak 1955-ben írták le) kloroplasztisza az egyik legkisebb méretű (107.122 bp; #NC014589), amelyet már csak az élősködő növények (pl. aranka) génvesztett kloroplasztisz méretei múlnak alul (Cuscuta obtusiflora) (85.286 bp; NC009949).

Image Text

3. ábra A kloroplasztisz genom (cpDNS) méretei. A nyitvatermő (Pinus) és zárvatermő (Populus) fák összehasonlítása a zárvatermő egyés kétszikűekkel. (1) Cycas taitungensis NC009618. (2) Amborella trichopoda NC005086. (3) Platanus occidentalis NC_008335. (4) Vitis vinifera NC007957. (5) Nuphar advena NC008788. (6) Nymphaea alba NC006050. (7) Liriodendron tulipifera NC008326. (8) Morus indica NC008359. (9) Prunus persica NC014697. (10) Populus trichocarpa NC009143. (11) Populus alba NC008235. (12) Arabidopsis thaliana NC000932. (13) Euglena gracilis NC001603. (14) Zea mays NC001666. (15) Hordeum vulgare NC008590. (16) Triticum aestivum NC002762. (17) Oryza sativa Japonica NC001320. (18) Oryza sativa Indica NC008155. (19) Equisetum arvense NC014699. (20) Marchantia polymorpha NC001319. (21) Lathyrus sativus NC014063. (22) Welwitschia mirabilis. NC010654. (23) Cedrus deodara NC014575. (24) Pinus longaeva NC011157. (25) Durinskia baltica NC014287. (26) Pinus monophylla NC011158. (27) Gnetum parvifolium NC011942. (28) Ephedra equisetina NC011954. (29) Cathaya argyrophylla NC014589 (1955). (30) Cuscuta obtusiflora NC009949. (31) Euglena longa NC002652. (32) Epifagus virginiana NC001568. Cucumis melo: 156.017 bp cpDNA (NC015983).

A cpDNS méretében a Floydiella terrestris zöldmoszat hatalmas kloroplasztisz-DNS-e a máig legnagyobb szekvenált cpDNS-minta (521.168 bp; #GU196268.1). A mitokondrium genom méretére néhány adat: az apró genomú emberi (Homo s.) mtDNS 16.569 bp hosszú (#NC012920), összehasonlítva a növényi mtDNS méreteivel: pl. a lúdfű (Arabidopsis th.; 366.924 bp; #NC001284), szágópálma (Cycas taitungensis, 414.904 bp; #NC010303), szőlő (Vitis v., 773.279 bp; NC012119) és a sárgadinnye (Cucumis melo) eddig legnagyobb, óriásméretű mtDNS-ével (2.900.000 bp).

A fák evolúciója

Az első és legősibb zárvatermő lombos fa (Amborella trichopoda) közel 140 millió ével ezelőtt jelent meg és ma is él az Új Kaledóniai szigeteken. Alacsony kétlaki kisméretű fa, amely egyivarú virágainak felépítésében már zárvatermő, de a fatörzs szerkezetében még nyitvatermő, mert fatestében csak vízszállító fasejtek (tracheidák) vannak, mint minden nyitvatermő (fenyőféle) fában. A kétlakiság is ősi bélyegnek tekinthető, mert a nyitvatermők között az ősi Ginkgo és a Cikászok is kétlakiak. A Gnetumok és a fenyők ’már’ egylakiak (igaz a legősibb nyitvatermő, a fenyők közé tartozó Podokarpuszok egylakiak). A nyitvatermőkben nem alakult ’még’ ki kétivarú virág.

Az evolúcióban ’fejlettebb’ zárvatermő lombos fa törzsében, az egymás fölötti fasejtek (tracheida) egybenyílásából kialakultak a facsövek (tracheák) (130 - 140 millió évvel ezelőtt) és jelen vannak minden zárvatermő lombos fában. Ha figyelembe vesszük a három fenti nyitvatermő ’leg’-fafajt, a fatestnek ez a ’fejlődése’ nem lett ’sikeresebb’ (viszont ez tehette lehetővé a gyümölcsfák gyümölcsének megjelenését a tobozok helyett).

A lombosfák evolúciós kirajzása az alig száz ősi kétszikű ’ANITA’ faj (basal dicots) megjelenésével kezdődött: ezek a fás Amborella (Új Kaledónia, 1 faj) mellett a lágyszárú Nymphaea (tündérózsa, vizitök, stb; Euramerika; 50 faj); a fás, örökzöld Illicium (pl. csillagánizs; Ázsia, Amerika; 42 fafaj), a fás Trimenia (Ausztrália, 8 faj) és a szintén fás, kúszó lián Austrobaileya (Ausztrália, 2 faj) fajai. Az ősi kétszikűeket követték a valódi kétszikűek (eudicots), közöttük a legtöbb fafajt (250) magába foglaló pillangós családot (Fabaceae), és a Rosaceae család legjelentősebb gyümölcsfáit (alma, körte, barack, szilva stb.). A pillangósok családja (Fabaceae) azért is nevezetes, mert az Astragalus (Csüdfüvek) nemzetsége a legnagyobb fajszámú (2.500 faj) növénynemzetség. Csak két növényrendben (Gunnerales, Geraniales) nem alakult (még) ki fa.

Vízfelvétel, gyors növekedés, aquaporin gének

A növények gyors növekedése, ezzel fitoremediációs kapacitása, attól függ, hogy milyen intenzíven és hatékonyan tudják felvenni a vizet és a benne oldott tápelemeket. A vízfelvétel genetikai szabályozása elsősorban az aquaporin (aqp) gének által kódolt AQUAPORIN (AQP) sejthártyafehérjék aktivitásának a függvénye (Agre P, kémiai Nobel díj, 2003). Az AQP fehérjék a MIP (major intrinsic protein) csoportba tartoznak, és aminosav-összetételükre az igen magas alanin-, glicin- és treonintartalom jellemző (4. ábra).

Image Text

4. ábra Két aquaporin fehérje (NIP5-1, BOR1) aminosav-összetétele (aa %) összehasonlítva a növényi Kálium-ion csatorna, az emberi miozin, és a pókfonál (dragline silk) aa-összetételével.

A MIP aquaporinok (26-30 kD) működése megegyezik az állatokban, ahol 13 típusuk van, és a növényekben, ahol 5 csoport ismert: PIP, TIP, NIP, SIP és XIP (PIP - plasma membrane intrinsic proteins, TIP - tonoplast intrinsicproteins, NIP - NOD26-like intrinsic proteins of symbiosome membranes, a SIP - small basic intrinsic proteins, és a be nem sorolt XIP intrinsic proteinek). Az aminosav-szekvenciákból szerkesztett filogenetikai hasonlósági dendrogram három fő csoportba osztja az AQP fehérjéket, köztük az igen intenzív vízfelvevő tökféléket és a leggyorsabban növekvő nyárfákat (Populus) és a nyitvatermőket (Pinus, Picea) (5. ábra).

A fák hosszú élete és nagy tömege is a vízfelvétel függvénye. Növekedési erélyben is úgy tűnik, hogy a nyitvatermők a leghatékonyabbak. A gödöllői Arborétum kísérleti telepén látható olyan 40 éves mamutfenyőtelepítés, amely kétszer akkora fatömeget hozott, mint a 80-éves telepítésű feketefenyő (1. ábra), és többszörösét, mint a lombos fák.

A lágyszárú zárvatermők között a Cucurbitaceae fajai (pl. tök, uborka, dinnye) a legintenzívebb növekedésűek (ld. a világ legnagyobb termését adó takarmánytököt).

Image Text

5. ábra Az aquaporin fehérjék (AQP, NIP, NOD and Si-TRP) filogenetikai kapcsolatai. A nyitvatermő (Pinus, Picea) és zárvatermő (lágyszárú és fás) fajok, valamint a ’külső csoport’ Selaginella csipkeharaszt kiemelésével. A fehérjeszekvenciák (NCBI) letöltése, blast-elemzése és illesztése után a dendrogram szerkesztése Mega4 (Tamura et al. 2004) programmal történt a génbanki (NCBI) számok, a relatív genetikai távolság (mérce) és a bootstrap (x1000) értékek feltüntetésével.


Fitoremediáció

A fitoremediáció ma már egy technológia, amelyben növényekkel történik a talajszennyeződések eltávolítása: a szennyezett talaj megtisztítása, remediálása. Összehasonlítva a fizikai (pl. talajelhordás), kémiai (pl. Na2EDTA kelát-kezelés) és biológiai (pl. baktériumok alkalmazása) remediációs módszerekkel, a növények használata költséghatékony és kevésbé káros a környezetre. A mérgezés felszámolása történhet lebontással, talajból történő kivonással (fitoextrakció), vagy a szennyezőanyagok megkötésével, immobilizációjával.

A fitoextrakció során, a növények tápanyagfelvevő mechanizmusát használjuk fel a szennyezőanyagok talajszint feletti szövetekben történő akkumulációjához. Néhány évi növekedés után a föld fölötti biomasszát begyűjtve a szennyezés eltávolítható a területről. A növényanyag elégetéséből (bioenergia) visszamaradt hamuban tovább koncentrálódnak a szennyezőanyagok, amelyeket újrahasznosíthatunk, vagy lezárt hulladéktárolókba helyezhetünk.

Fitoextrakcióra azok a növények alkalmasak, amelyek képesek a szennyezőanyagok gyors felvételére, és a föld fölötti szöveteikben történő akkumulációjára/tűrésére/lebontására, amelyre a Populus fajok kiemelten alkalmasak. Ültetésük egyszerű, jól gyökeresednek, vegetatív úton könnyen szaporíthatók, növekedésük gyors (4-5 méter/év).

A Populus fajokra, a fás növények közül a legjobban tanulmányozott fajokra, számos módszert dolgoztak ki erdészeti, vegetatív szaporítási, szövettenyésztési, géntranszformációs nemesítési és betakarítási eljárásokra. A nyárfajoknak magas a transpirációs rátájuk, hosszú gyökérzetük révén elérik a talaj mélyebb vízrétegeit, könnyen adszorbeálják, lebontják és/vagy detoxifikálják a szennyezőanyagokat, miközben gátolják a talajeróziót is. Fajai világszerte elterjedtek főként az ártéri területeken, így nagy valószínűséggel található a potenciális fitoremediációs területekre megfelelő Populus faj. A nyár nem része az emberi tápláléknak, habár számos állatfaj hasznosítja táplálékként (pl. rovarok) és lakhelyként (pl. madarak). Mindezek alapján a Populus fajok ideális jelöltek a fitoremediációra történő nemesítésre (1. táblázat). A legtöbb nyárfával végzett fitoremediációs feladatot az Egyesült Államokban dolgozták ki, ahol már több erre szakosodott gazdasági társulás alakult. Ezek között is a legfontosabbak a glutation (GSH) alapú fitoremediációra génnemesített 35S-gshI transzgénikus nyárfák.

A GSH (glutation) és szerepe a stressz elleni védekezésben

Rey-Pailhade 1888-ban izolált élesztőből egy olyan vegyületet, amely elemi kénnel reagálva spontán reakcióban hidrogén-szulfidot termelt. A vegyületet két görög szó felhasználásával filotionnak ("kenet szerető") nevezte el (Meister, l988). 1921-ben Hopkins vizsgálta újra ezt a vegyületet, és először (tévesen) glutamátból és ciszteinből álló dipeptidként jellemezte. A két aminosav kapcsolódására utalva Hopkins nevezte el a vegyületet glutationnak (GSH) (glutaminsav+filotion+pepton), amely elnevezés egyben az eredeti filotion névhez és az egyszerű peptideket jelző pepton végződéshez is kapcsolódott. Hopkins később megismételte vizsgálatait, és 1929-ben helyesen ismerte fel a GSH tripeptid voltát.

A redukált GSH (γ-L-glutamil-L-ciszteinil-glicin) oxidált formája a GSSG, melyben két GSH molekula kén-hídon keresztül kapcsolódik össze. A GSSG visszaalakulását GSH-vá a glutation reduktáz enzim (GR) katalizálja és a reakcióhoz a fotoszintetikus elektrontranszport-láncban termelődött NADPH-t használja fel. A GSH a növényi antioxidáns rendszer fontos eleme. Szintézisének két utolsó lépésében két ATP-t igénylő lépés van.

Az elsőben a γ-glutamil-cisztein (γ-EC) jön létre a glutaminsav és a cisztein között, amelyben nem a szokásos peptidkötés alakul, ki hanem egy speciális peptidkötés, amelyben a glutaminsav nem az α-, hanem a γ-karboxilcsoportjával kapcsolódik a ciszteinhez, aminek következtében a glutationt a proteolitikus enzimek nehezen tudják lebontani.

Image Text

6. ábra A glutation bioszintézisének két utolsó enzimatikus lépése és a reakciókat katalizáló enzimek.

A második lépésben a glicin kapcsolódik a C-terminális helyzetű ciszteinhez, így alakítva ki a glutation tripeptidet. Az első lépést a γ-glutamilcisztein szintáz enzim (γ-ECS) (kódoló génje a gsh1), a másodikat a glutation szintáz enzim (GS) (kódoló génje a gsh2) katalizálja. A reakció végbemegy a citoszolban és a kloroplasztban is (6. ábra).

A GSH a stressz elleni védelemben több ponton is hat, melyek közül a reaktív oxigéngyökök elleni védelem (különösen a membránlipidek és -proteinek védelme), a H2O2 elleni védelem (az aszkorbinsav regenerációján keresztül), és a fitoremediációs kapacitást biztosító nehézfémkötő fehérjék (HMBP – heavy metal binding proteins) (pl. fitokelatinok) prekurzoraként a teljes növényi nehézfémtűrésben tölt be központi szerepet.

A fitokelatinok kiinduló molekulája a GSH, melyek bioszintézisét a fitokelatin szintáz enzim katalizálja:
(γGluCys)nGly + (γGluCys)nGly => (γGluCys)n+1Gly (n = 1,2,3…). A Cu, Cd, Pb és a Zn különösen jól kötődnek a Cys (cisztein) tiol (SH) csoportjához, oldható fémkelátot hozva létre.

A GSH, hasonlóan a többi kéntartalmú peptidhez, a xenobiotikumok (kémiai szennyeződések) nagy csoportjával képes reakcióba lépni (pl. GSH-herbicid komplex), amelyeket az ABC transzporterek (ATP binding casette) szállítanak a vakuólum ’depóba’.

A fák biotechnológiai modellnövénye a nyárfa

A nyárfa az erdészeti biotechnológiai kutatások modellnövénye. Ezt annak köszönheti, hogy rendelkezik számos olyan, a többi fás növényben együtt nem jelentkező tulajdonsággal, amelyek megkönnyítik a biotechnológiai és molekuláris biológiai kutatásokat. Ezek a következők:

  • Kisméretű a nukleáris genom (2. ábra), a haploid genom mérete 0,485±10 x 109 bp, hasonló a rizsgenom méretéhez, és csak 4 x nagyobb az Arabidopsisénál, de 40 x kisebb, mint a fenyő genomja;
  • Ismert a Populus trichocarpa teljes genomszekvenciája (Tuskan et al. 2006);
  • Könnyű a vegetatív szaporíthatóság, amellyel a genetikai állomány változatlanul fenntartható;
  • Gyors a növekedése és a termőre fordulása, a kísérletek viszonylag gyorsan (8-10 év) elvégezhetők;
  • Könnyű transzformálhatóság, könnyű transzgénikus fák előállítása.

4. Génbevitel nyárfába

A nyár genomszekvencia-adatai szabadon hozzáférhetők. Mindezen jó tulajdonságok alapján nem meglepő, hogy az első transzgénikus fa szintén a nyár volt, amelyet 1987-ben állítottak elő, a bevitt tulajdonság a glifozát-rezisztencia volt (1. táblázat).

A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus szürke nyárfák jellemzői

A vizsgálatainkhoz a szürkenyárhibrid (Populus tremula × Populus alba = Populus × canescens) két transzformáns klónját alkalmaztuk (INRA No.717-1-B4): a 11ggs és a 6lgl klónokat, összehasonlítva a nem transzformált szürkenyárral (WT). A növények az Escherichia coli baktériumból származó γ-glutamil-cisztein szintáz (γ-ECS) enzimet kódoló gént (gsh1) hordozták.

A gén eredeti start-kodonját (TTG) PCR technikával ATG szekvenciára módosították. Magát a kódoló szekvenciát (1,7 kb) tartalmazó HindIII/SmaI fragmentumot a pLBR19 plazmidba klónozták. A promóter a karfiolmozaik-vírus (CaMV) konstitutív 35S promótere volt, dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával (p70) és a CaMV poli-A szekvenciájával. Ezt a CaMV-35S promóter – gshI – poli-A gén-kazettát a pBIN19 bináris vektorba klónozták egy SstI/XbaI inszertben. Az így elkészített vektort építették be az Agrobacterium tumefaciens C58 (pMP90) törzsébe, és végezték el a szürkenyárhibrid (P. × canescens) genetikai transzformációját.

Kétféle gshI-génnel transzformált nyárfa klóntípust állítottak elő. A 11ggs klónban (35S-gshI-11ggs) a transzgén fehérjeterméke a citoszolban expresszálódik. A 6lgl klónban (35S-rbcS-gshI-6lgl) a CaMV-35S promóter és a gshI gén közé beépítették a borsó RUBISCO gén kis alegységének tranzit peptidjét (borsó rbcS), aminek következtében a gshI gén terméke beszállítódik a kloroplasztiszba (7. ábra).

A transzgénikus klónokban a GSH-tartalom 2-4-szer nagyobb lett, mint a kontroll klónokban. A szürkenyárklónok (11ggs, 6lgl, kontroll) steril hajtásai Németországból (Albert-Ludwigs-Universität, Institut für Forstbotanik und Baumphysiologie, Freiburg, Prof H Rennenberg) érkeztek.

Image Text

Jelmagyarázat: aroA: mutáns EPSP szintáz, AS: antiszensz; bar: foszfinotricin acetyl transzferáz; cad: cinnamil alkohol dehidrogenáz; cat: kloramfenikol acetil transzferáz; comt: kávésav O-metil transzferáz; CpTI: tripszin inhibitor; crs1-1: mutáns acetolaktát szintáz; cryIA(c), cryIA(a), cryIIIA: Bacillus thuringiensis δ-endotoxin gének; FeSOD: vas szuperoxid dizmutáz; GS: glutamin szintáz gshI: γ-glutamilcisztein szintáz gshII: glutation szintáz gor: glutation reduktáz gus: β-glükuronidáz; ipt: izopentenil transzferáz; iaaH: indol-3-acetamid hidroláz; iaaM: triptofán-2-mono-oxigenáz; luxF2: luciferáz; mtlD: mannitol-1-foszfát dehidrogenáz; ocI: rizs cisztein proteináz inhibitor; p: promóter; phyA: fitokróm A; pinII: burgonya proteáz inhibitor II; StSy: stilbén szintáz.

Image Text

7. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgén-kazetta felépítése. (A) A citoszolban expresszálódó 35S-gshI-11ggs transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció. LB: bal oldali határoló régió; P-p70: karfiolmozaik-vírus 35S promótere dupla felerősítő (enhancer) szekvenciával; gsh1: a γ-ECS enzimet kódoló gén szekvenciája; T-35S: karfiolmozaikvírus poli(A) szekvenciája; T-nos: nopalin szintáz promótere; nptII: neomycin foszfotranszferázt kódoló gén szekvenciája; Pnos: nopalin szintáz terminátor szekvenciája; RB: jobb oldali határoló régió. (B) Az rbcS tranzitpeptiddel a kloroplasztiszba szállított 35S-rbcS-gshI-6lgl transzformációhoz alkalmazott bináris vektor konstrukció a γ-ECS kloroplasztiszban való túltermeltetéséhez. rbcS: borsó RUBISCO enzim kis alegységének tranzitpeptidjét kódoló része.

A 35S-gshI transzgénikus szürke nyár mikroszaporítása in vitro

A növények mikroszaporítása nodális hajtástenyészetben in vitro történt WPM táptalajon (8. ábra).

Image Text

8. ábra A transzgénikus 35S-gshI transzgénikus szürkenyár (P. x canescens) mikroszaporítása in vitro. (1) a kiinduló gyökeres hajtástenyészetből vágott, (2) nodális szárdarabokon megindul, (3) az alvórügyek kihajtása, (4) és teljes kifejlődése, majd (5) gyökereztetése, a (6) a nagy mennyiségű klón előállításában.

A 35S-gshI és a 35S-rbcS-gshI transzgén beépülő kópiaszámának és expressziójának meghatározása (qPCR)

A 35S-gshI transzgén beépülési kópiaszámának meghatározása, a konstitutívan expresszálódó actin gén kontrolljában végeztük, tervezett primerekkel (Primer3’, NCBI), qPCR elemzésben (25 μl) (Corbett Gene 6000), DyNAmo HS SybrGreen I qPCR Kit (# F-410L, Finnzymes, Finland – Izinta) felhasználásával, a 2−ΔΔCt módszer kiértékelésével (9. ábra).

Az RT-qPCR eredmények szerint, a 35S-gshI transzgén a 35S-gshI-11ggs klónban magasabb (1,6) beépülési kópiaszámot mutatott, mint a 35S-rbcS-gshI-6lgl klónban (1,0), amelyben azonban a transzgén expressziója 13,5-szöröse volt a folyamatos kloroplasztiszba történő géntermék (GSH) szállításának eredményeként (9. ábra).

Image Text

9. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus-, valamint a kontrol (WT) szürke nyár (2n=4x=38) klónok (P. x canescens) transz/gén beépülésének és saját Pop.gsh1 génjének kópiaszáma és relatív génexpressziója. A relatív génexpressziót a génekről átírt mRNS-ek mennyiségének mérésével határoztuk meg a totál RNS (0,05 g levélszövetből kivonva, és NanoDrop ND-1000 UV-Vis spectrofotométerrel ellenőrizve) mintákból szintetizált cDNS-ből. A nyárfa saját gshI génjének (Pop.gsh1-mRNS), valamint a két transzgén konstrukciónak (35S-gshI-11ggs-mRNS és a 35S-rbcS-gshI-6lgl-mRNS) az mRNS mennyiségét az a-tubulin (a-tubulin-mRNS) és az aktin (actin-mRNS) mRNS-ének mennyiségéhez (1,0) viszonyítottuk (Absolutely RNA Miniprep Kit (# 400800, Stratagene, USA - Biomedica, Magyarország) követve a protokollt. cDNA szintézis: Az mRNS-ek reverz transzkripciójához (cDNS szintézis) RT-t (reverse transcriptase, Moloney Murine Leukemia Virus: M-MuLV), oligo(dT)18 (0,5 μg) és 3’-primert alkalmaztunk (#K1622; Fermentas – Biocenter, Szeged, Hungary). Génexpresszió mérése: Az egyszálas cDNA-mintákat (2,5 μl) közvetlenül vittük qRT-PCRbe (25 μl) a megtervezett primerekkel (400 nM) (‘Primer3’ NCBI) DyNAmo HS SybrGreen I qPCR kitben. A qRT-PCR ciklusai: 10 perc elődenaturációt (95 °C) követő 35 amplifikációs ciklus (95 °C/20 sec, 60 °C/20 sec, 72 °C/20 sec) 4°C-os véghűtéssel (Rotor Gene 6000, Corbett Research, Australia). Az adatok kiértékelése. A kalibrációhoz és a qvantáláshoz 10-szeres cDNS koncentrációsorban történt (1x, 10x, 102x, 103x cDNA) (10. ábra), NTC (non DNA-template control) és ddH2O kontrollal. A számítás (Ct, ΔC, ΔΔCt meghatározása) 2−ΔΔCt módszerrel történt: Ct-szint (threshold cycle): A küszöbértékének meghatározása a felszaporodó cDNS-fragmentum küszöbérték feletti fluoreszcencia értékéből (dR) történt kézi illesztéssel. A standard görbe, amely a Ct-érték és a felszaporodó cDNS-fragmentum fluoreszcenciája közötti korrelációt mutatta magas R2-értékű volt (0,987). ΔC: ΔCt értéke a CtEcol.gshI – Cta-tubulin és a CtPop.gsh1–Cta-tubulin különbségét mutatja. ΔΔCt values: A ΔΔCt érték Ct(kezeletlen) átlaga – Ct(kezelt) átlag különbségének a 2−ΔΔCt értéke.

Image Text

10. ábra A gshI transzgén kimutatása RT-qPCR-el a 35S-gshI-11ggs (-●-) és a 35S-rbcS-gshI-6lgl (-■-) transzgénikus szürkenyárklónokban. A PCR ciklusok száma (Cycles) és a DNS-be kötődő SybrGreen festék fluoreszcenciája (dR) közötti korrelációs görbe. A reakció kalibrációja és kvantálása 10-szeres cDNS koncentrációval (1x, 10x, 102x, 103 mennyiségű cDNS; az ábrán ’Standard 1,2,3,4’) és NTC (DNS nélküli kontroll; non DNA-template control) alkalmazásával történt.

A transzgén működésének reaktivációja DHA-indukált DNS-demetilációval

A TGS (transzkripcionális géncsendesítés) leghatékonyabb módja, az adott szervben szükségtelen gének működésének (expressziójának) elhallgattatása (gene silencing). Mindkét TGS, a fehérje szintű (az adott gén környezetében levő hiszton fehérjék de/acetilálása, a HDAC: hiszton deacetiláz katalízisében), és a DNS szintű (a gén citozin bázisainak metilálása 5metC-vé, a DNMT: DNS-metiltranszferáz katalízisében) indukálható kémiai kezeléssel. Vizsgálatainkban a humán rákterápiában alkalmazott, nem metilálható citozin-analógot a DHAC-t (dihidro-azacitidin) alkalmaztuk. A DHC képes beépülni az éppen osztódó sejt replikálódó DNS-ébe, ezzel az utódsejtekben az adott gén citozinjainak metilálhatatlanságával az adott gén reaktiválódik. Megállapítottuk a két transzgén (a 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl) mellet a nyárfa saját gsh1 génjének nagyságrendi (10x) reaktiválódását a két transzformált nyárfában és nem transzformált (WT) klónban (11. ábra).

Image Text

11. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgének (E. coli), valamint a nyárfa (Populus x canescens) saját (WT) gsh1 génjének reaktiválása DHAC (4x10-7 M) kezeléssel (21 napig kezelt in vitro levélkorong-tenyészetben).

Funkcionális elemzések: a transzgén hatása a nyárfa egyéb génjeinek (gst) működésére

Paraquat stressz alatt (4x10-7 M, 21 nap, levélkorong-tenyészet) a transzgénikus klónokban megvizsgált saját GST-enzimaktivitás (glutation S-transzferáz) pozitív serkentést (co-expressziót) mutatott a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgénikus klónban. Ez az eredmény igazolja, hogy a kloroplasztiszban, a fotoszintetikus elektrontranszport láncára ható paraquat elleni védekezéshez felhasználódik a kloroplasztiszba szállított transzgén által kódolt GSH is (12. ábra).

Image Text

12. ábra A 35S-gshI-11ggs és a 35S-rbcS-gshI-6lgl transzgén hatása a nyárfa egyéb génaktivitására. A gst által kódolt GST enzim (glutation S-transzferáz) aktivitásának változása eltérő szénellátás (2% -▲-, - 1% -●-, - 0,2% -■- szacharóz) és fény (16 h fény/8 h sötét fotoperiódus és folyamatos sötét inkubációval -▼-, -◄-), valamint paraquat stresszben (4x10-9 – 4x10-6 M) (az átlagértékek és a szórás jelölésével; n=3).

A vizsgálati eredmények igazolják, hogy a transzgénikus 35S-gshI nyárfaklónok (Populus) közel 10-szer aktívabban képesek a talajszennyeződések felvételére, ezért alkalmazásukkal tizedére csökkenthető egy szennyezett (ld. napjaink vörösiszap-katasztrófái) terület remediálása.

Köszönetnyilvánítás:

A vizsgálatokat az OTKA-K77641 és az OTKA-PD75169 pályázat támogatta.


Ajánlott irodalom

  • Bittsánszky A, G Gyulai, G Gullner, J Kiss, Z Szabó, Gy Kátay, L Heszky, T Kőmíves (2009): In vitro breeding of grey poplar (Populus × canescens) for phytoremediation purposes. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 84: 890–894.
  • Gullner G, G Gyulai, A Bittsánszky, J Kiss, L Heszky, T Kőmíves (2005) Enhanced Inducibility of Glutathione S-Transferase Activity by Paraquat in Poplar Leaf Discs in the Presence of Sucrose. Phyton 45: 39–44.
  • Gyulai G, Z Tóth, A Bittsánszky, Z Szabó, G Gullner, J Kiss, T Kőmíves and L Heszky (2008a) Gene up-regulation by DNA demethylation in 35S-gshItransgenic poplars (Populus x canescens). in: Genetically Modified Plants: New Research Trends. Eds. T Wolf and J Koch, Nova Science Publisher, Inc. USA, Chapter 8, pp. 173–191. ISBN 978-1-60456-696-3.
  • Kőmíves T, Gullner G (2000) Phytoremediation. In: Plant-Environment Interactions (RE Wilkinson ed.), Marcel Dekker Publ, New York, pp. 437–452.
  • Malone R, Dix PJ (1990) Mutagenesis and triazine herbicide effects in strawberry shoot cultures. J Exp Bot 41: 463–469

A cikk letöltése pdf formátumban.

Sze­ge­di Tu­do­má­nyegye­tem, Bio­ló­g­ia Épü­l­et, Szent-Györ­gyi Al­bert te­rem (BI-164)
Sze­ged, Kö­z­ép fa­sor 52.

2018. má­j­us 16. 14 óra

Dr. Bő­s­ze Zsu­z­san­na

"Ge­nom­s­zer­kesz­tés­s­el lét­re­ho­zott ha­s­zon­ál­l­at mo­del­lek a gyó­gyí­t­ás szol­gá­la­tá­b­an"

Dr. Bán­fal­vi Zsófia

"Ge­nom­s­zer­kesz­tés­s­el ne­me­sí­tett nö­v­é­nyek: ho­gyan csi­nál­juk és mi­re jók?"

Dr. Györ­gyey Já­n­os

"GMOk-e a gén­s­zer­kesz­tett él­ő­l­é­nyek? És ha igen, mi­ért nem?"


Ima­ge Text

Bu­da­pest, Vil­lá­nyi út 29-43.
K épü­l­et
Szent Ist­ván Egye­tem Bu­dai Cam­pu­sá­n­ak K2-es előa­dó­ja

2018 . áp­ri­lis 24. 17 óra

Dr. Éva Csa­ba

"Crispr/Cas ge­nom­s­zer­kesz­tés a ne­me­sí­t­és­ben:mű­kö­d­és és al­kal­ma­zá­si le­he­tő­s­é­g­ek"


flyer

A Ma­gyar Tu­do­má­nyos Aka­dé­m­ia a Ma­gyar Tu­do­mány Ün­n­e­pe ren­dez­vény­s­o­ro­za­tá­n­ak ke­re­tén be­lül tisz­te­let­tel meg­hív­ja prof. Dr. Du­dits Dénes aka­dé­m­i­kus előa­dá­s­á­ra.


2017. no­vem­ber 6., 18:00 óra MTA Szék­ház, Dísz­te­rem

1051 Bu­da­pest, Szé­c­he­nyi Ist­ván tér 9.

Du­dits Dénes aka­dé­m­i­kus
A pre­cí­z­i­ós ne­me­sí­t­és mint bi­o­gaz­dál­ko­dá­si in­no­vá­c­ió


Dr. Györ­gyey Já­n­os
Az elő­r­e­lé­p­és le­he­tő­s­é­g­ei a gén­tech­no­ló­g­i­á­r­ól va­ló tár­s­a­dal­mi vi­tá­b­an


Image Text

Legfrissebb
  • Batáta, az anyatermészet génmódosítása

    A há­z­i­a­sí­tott éd­es­bur­go­nya és an­nak kö­z­e­li vad ro­ko­nai kö­z­ött fon­tos kü­l­önb­sé­g­et fe­de­zett fel egy ku­ta­tás. A ba­tá­ta ge­nom­já­b­an ugya­n­is ket­tő, Ag­ro­bak­té­r­i­um ál­tal be­vitt gént ta­lál­tak. Ezek a gé­n­ek pe­dig nem csak je­len van­nak a ge­nom­ban, ha­nem ki is fe­je­ződ­nek, ami ar­ra en­ged kö­v­et­kez­tet­ni, hogy olyan hasz­nos tu­laj­don­ság ki­a­la­kí­t­á­s­á­b­an van sze­re­pük, ami a há­z­i­a­sí­t­ás so­rán sze­lek­ci­ós előnyt je­len­tett a ba­tá­t­á­n­ak.

  • Mérgező élelmiszer a polcokon

    A GM nö­v­é­nyek­kel el­len­tét­ben a nö­v­ény­vé­d­ő­s­z­er­rel szen­nye­zett ter­mé­nyek­ről ke­vés hír szól. Ér­d­e­mes át­bön­g­ész­ni a táb­lá­z­a­tot. Köz­ben fel­me­rül a kér­d­és, hogy vegy­s­zer­men­tes GM nö­v­ény­től vagy a mér­ge­ző re­tek­től kell-e job­ban fél­ni.

  • Mit mondanak azok a kutatások, amiket nem a multik pénzelnek?

    Az el­múlt 60 év so­rán 698 ku­ta­tás fog­lal­ko­zott GM-nö­v­é­nyek­kel. A köz­le­mé­nyek több, mint fe­le tel­je­sen füg­g­et­len ku­ta­tók­tól szár­ma­zik, va­gy­is nem "lob­bi­zik" az egyik vagy a má­s­ik ol­dal mel­lett - nem ér­d­e­k­elt a kí­sér­l­e­tek ki­me­ne­te­lé­b­en. Ezek a füg­g­et­len ku­ta­tók pe­dig rend­re biz­ton­sá­g­os­nak ta­lál­ták a gén­tech­no­ló­g­i­á­v­al ne­me­sí­tett nö­v­é­nye­ket.

Korábbi hírleveleink:
Hírlevél feliratkozás

Iratkozzon fel kéthavonta megjelenő hírlevelünkre email címével!

Keresés